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AIDS的检测方法

2006/6/2 20:30:20


A1 初筛方法
A1.1 颗粒凝集法(Particle Agglutination Test)
试验步骤:
a)吸75μL血清稀释液放入第一孔内,第二、三孔分别加25μL血清稀释液。
b)加血清标本25μL于第一孔内用微量吸管反复吸排3~4次,使其内液体混匀,然后吸25μL第一孔液至第二孔混匀,再从第二孔吸25μL液至第三孔混匀,最后从第三孔吸25μL液丢掉。
c)用吸管加一滴(25μL)未致敏颗粒于第二孔内,加一滴致敏颗粒于第三孔内。
d)用水平式振荡器振荡30~60s,然后盖上盖子平放在室温15~25℃,2h看结果。
e)结果说明:
试验完成后加未致敏颗粒(最后血清稀释度为1∶16)应显示阴性反应,而加致敏颗粒(最后血清稀释度为1∶32)如显示凝集反应者则为阳性,第一孔为空白对照。
每次试验需有阳性对照和阴性对照。如结果不能肯定可用其他方法重复检测。
A1.2 ELISA酶联免疫法(Enzyme-linked Immunosorbent Assay)
A1.2.1 间接的酶联免疫法
结果说明:有抗HIV抗体者显色为阳性,无色为阴性。
A1.2.2 竞争EIA
结果说明:病人血清有抗HIV抗体者无色或很淡色,而病人血清中无抗HIV抗体者显明确的颜色。
A1.2.3 抗原夹心法(或抗体捕获法)
抗原+病人血清(有或无抗HIV抗体)+酶标抗原。
此法比较敏感和特异,因为可以检测病人血清中LgA、LgM、LgG抗HIV抗体。
结果说明:显色为抗HIV抗体阳性,无色为阴性。
试验步骤[a)和c)]如Bio-Rad试剂采用的间接法:
a)在已包被好抗原的孔内加200μL稀释液。
b)加病人血清和阳性、阴性对照液各10μL于稀释液的孔内。
c)盖上盖在37℃±2℃孵育30min,同时准备酶标物。
d)用清洗液清洗各孔6次,每孔300μL,吸干每孔内水分。
e)加100μL酶标物,37℃±2℃孵育15min,同时准备底物。
f)用清洗液清洗6次,吸干每孔。
g)加底物(OPD,邻苯二胺)100μL至每孔,在37℃±2℃孵育15min。
h)加终止液100μL至每孔,轻敲微孔板。
i)在492nm波长中读出O.D.值(必须在加终止液后1h内读O.D.值)。
j)每次实验必须有多于2个阳性和2个阴性对照值。
计算Cutoff值=(0.1×阳性对照的平均O.D.值)十阴性对照的平均O.D.值。
结果说明:O.D.值>Cutoff值者为阳性,一旦有阳性的则需重复一次,如果仍阳性,需作蛋白印迹法,或免疫荧光法确证试验。有些试验盒同时有HIV-1和HIV2,有些则只能测HIV-1。中国、美国和西欧的HIV-1多见,西非有HIV-2。
本法能检测出血清中IgM抗体,对早期感染者有帮助。
A1.3 免疫荧光检测
抗原底片:玻片中每孔内固定有细胞,细胞内有HIV抗原。
检测步骤:
a)将待测血清以1∶10稀释,加在HIV抗原的孔内,每玻片设一阳性对照和一阴性对照,37℃孵育45min。
b)用10mol/L pH7.2~7.6 PBS液洗三次,蒸馏水洗一次,晾干。
c)每孔内加入1∶16稀释的抗人IgG荧光标记抗体,37℃孵育45min。
d)PBS清洗三次,晾干。
e)用0.1%伊文氏蓝染色15min,取出稍干。
f)加50%甘油封片,在荧光显微镜下检测。
结果说明:细胞浆和细胞膜有翠绿色荧光者为阳性,暗红色为阴性。

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